支原體是最小的自由生存生物。它們屬于細(xì)菌類柔膜細(xì)菌目，其特征在于無細(xì)胞壁。因此，它們不受許多常用抗菌劑的影響。支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛存在的污染物。由于支原體非常微?。s 0.3 - 0.8μm），無法用光學(xué)顯微鏡觀察到支原體污染，受感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長率和形態(tài)的改變會很小且不明顯。但是受支原體污染的產(chǎn)品會造成人類健康風(fēng)險。所有這些都清楚地表明了對支原體常規(guī)檢測的高需求。

賽多利斯Microsart^? ATMP支原體檢測試劑盒能夠根據(jù)《歐洲藥典》2.6.7可靠、靈敏地檢測細(xì)胞培養(yǎng)中和細(xì)胞培養(yǎng)衍生生物制品中的支原體DNA。

在本研究中，通過使用賽多利斯的定量CFU和GC標(biāo)準(zhǔn)，對9種不同種類支原體基因組拷貝（GC）和菌落數(shù)（CFU）之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究。由于PCR技術(shù)僅檢測基因組拷貝（GC），而不同的監(jiān)管部門，如韓國食品和藥品監(jiān)督管理局（KFDA）和日本藥品和醫(yī)療器械管理局（PMDA）要求在通過細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品質(zhì)量控制所用的檢測前要提供菌落數(shù)（CFU）與基因組拷貝（GC）的相關(guān)性。本研究的結(jié)果表明，盡管不同種類支原體間的基因組拷貝數(shù)不同，但都成功關(guān)聯(lián)了20 CFU或是40 CFU的比例相關(guān)性。

材料和方法

Microsart^? 支原體驗證標(biāo)準(zhǔn)品的DNA提取

Microsart^? 支原體驗證標(biāo)準(zhǔn)品的每一包裝包含3個小瓶，每個小瓶包含 10 CFU 所選支原體種類。將 250μl 杜氏最低營養(yǎng)必需培養(yǎng)基（DMEM）+10%胎牛血清（FBS）加到兩個小瓶中，以制備一份濃度為 40 CFU/ml的懸浮液。將 500 μl DMEM +10%FBS加到一個小瓶中，以制備一份濃度為 20 CFU/ml的懸浮液。根據(jù)方案用Microsart^? AMP 提取試劑盒平行提取各細(xì)胞懸浮液的DNA。洗脫液直接用于Microsart^? ATMP 支原體qPCR 試劑盒檢測。

Microsart^? 校準(zhǔn)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1：針對不同種類支原體的Microsart^? 支原體驗證標(biāo)準(zhǔn)品和Microsart^? 校準(zhǔn)試劑的產(chǎn)品概述。

為了量化Microsart^? 支原體驗證標(biāo)準(zhǔn)品的 DNA 提取物，有必要使用已知濃度的基因組拷貝（GC）建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，使用了Microsart^? 校準(zhǔn)試劑。校準(zhǔn)試劑再水合后含特定細(xì)菌10? GC/μl 。在 Tris 緩沖液中制備稀釋梯度系列樣品，以使最終濃度達(dá)到5 GC/10μl 至 500 GC/10μl。

Microsart^? ATMP 支原體qPCR 試劑盒

對試劑盒里所有凍干組分再水化。針對一次反應(yīng)，將 15μl 的支原體混合物與 1μl 的內(nèi)標(biāo)對照 DNA 混合。將 15μl 該混合物加至每個 PCR 管中。每次至少使用兩個無模板對照（NTC）進(jìn)行檢測，并且平行取樣兩份。因此，將 10μl 的樣本或 NTC 分別加至帶有反應(yīng)混合物的 PCR 管中。

在熒光定量 PCR 儀 CFX96 Touch Cycler（Bio-Rad；45 個周期，3min 95 ℃，30s 95 °，30s 55 ℃，45s 60 ℃）上進(jìn)行Microsart^? ATMP 支原體 qPCR 檢測。支原體DNA由一條FAM? 熒光通道中的增強熒光信號表示。在同一試管中的 ROX? 通道中檢測到內(nèi)標(biāo)對照DNA，該試劑盒用 FAM? 和 ROX? 雙探針來指示 PCR 檢測系統(tǒng)的正常無抑制。使用CFX Manager Software（Bio-Rad）進(jìn)行反應(yīng)分析?！稓W洲藥典》/《美國藥典》中列出的所有支原體種類的檢測限為≤10cfu/ml。

結(jié)果

圖2和3顯示了萊氏衣原體的示例性擴增圖?；赾t值（FAM?通道）和標(biāo)準(zhǔn)濃度，CFX Manager軟件使用一個線性方程創(chuàng)建了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。回歸系數(shù)0.983表明標(biāo)準(zhǔn)曲線良好。最優(yōu) qPCR 的效率為100%。在這種情況下，擴增子 DNA 將在每個周期內(nèi)翻倍。根據(jù)對 CFX 軟件的分析，萊氏衣原體的示例性 qPCR 運行以101%的效率高效運行（參見圖1中的效率）。

圖1：使用Microsart^? ATMP支原體試劑盒產(chǎn)生的最終基因組拷貝（GC）濃度5 GC/10μl至500 GC/10μl的萊氏無膽甾原體（Microsart^? 校準(zhǔn)試劑）的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

每個樣本和無模板對照（NTC）都顯示了內(nèi)標(biāo)對照DNA的一個擴增，因此也造成了ROX?通道中的熒光信號（Ct<40；數(shù)據(jù)未示出）。表明了PCR檢測成功且無抑制。如預(yù)期，NTC在FAM?通道中未顯示熒光信號（參見圖2和圖3）。因此，表明了 PCR 反應(yīng)的無支原體制備無交叉感染。

圖2：Microsart^? ATMP支原體qPCR試劑盒生成的萊氏無膽甾原體的示例性擴增圖。

圖3：Microsart^? ATMP支原體qPCR試劑盒生成的萊氏無膽甾原體的示例性擴增圖。

已在所有樣本中成功檢測到20 CFU/ml 和40 CFU/ml 的每種支原體（測定LOD≤10cfu/ml；在試劑盒驗證期間確定）。

基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，軟件計算的支原體樣本GC濃度（20CFU/ml 和 40CFU/ml 提取物）。9 種不同種類支原體的平均GC/CFU比率如表2所示。

表2： 9種不同種類支原體的平均GC/CFU率

討論

在本研究中，使用賽多利斯定量 GC 和 CFU 標(biāo)準(zhǔn)研究了 9 種不同種類支原體的基因組拷貝（GC）和菌落數(shù)（CFU）之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明：GC 值高于 CFU 值。理論 GC:CFU 比率應(yīng)為1:1，因為理想情況下，每個細(xì)胞應(yīng)檢測一個GC。實際上，即使在早期指數(shù)增生期就收獲支原體培養(yǎng)物，以防止在制劑中檢測到死細(xì)胞DNA，該比率也是不可實現(xiàn)的。出現(xiàn)非等比是因為大量的支原體細(xì)胞不會在培養(yǎng)基中生長成菌落并不被檢測到（即，活的但非可培養(yǎng)的細(xì)胞）。此外，支原體細(xì)胞易于形成團(tuán)聚體，會被檢測為1個CFU，但實際上它結(jié)合了多個細(xì)胞，因此是好幾個GC。

這兩種情況都會嚴(yán)重低估細(xì)胞培養(yǎng)樣本中的真實支原體細(xì)胞數(shù)，因為只有一部分細(xì)胞會生長為一個CFU。使用基于生長的方法，不可培養(yǎng)的物種或可生存但不可培養(yǎng)的細(xì)胞可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。由于基于生長的方法中的假陰性結(jié)果而未檢測到支原體污染可能會產(chǎn)生具有潛在感染風(fēng)險的不安全產(chǎn)品，特別是對于免疫缺陷的患者，這種風(fēng)險會更嚴(yán)重。

總結(jié)

本研究表明：GC 和 CFU 之間的相關(guān)性可以成功地被證明，并且在驗證期間易于實施證明試驗。另外，可以通過 PCR 的 GC 檢測顯示各樣本中實際污染水平的一個更真實結(jié)果，因此直接有利于藥物安全。

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